Gen düzenleme teknolojileri, keşiflerinden yaklaşık yirmi yıl sonra artık ilk tedavi uygulamalarını görmeye başlıyor. Bu gelişmelerin karşılaştığı en büyük zorluklardan biri güvenlik. Düzenlemek istediğimiz gene oldukça spesifik hale getirilebilse de, insan genomu oldukça büyük ve nadir DNA dizileri bile şans eseri birkaç kez tekrar edebilir.
Sonuç olarak, orijinal gen düzenleme sistemlerinin tamamı, yanlış diziyi düzenledikleri 'hedef dışı etkiler' olarak adlandırılan bilinen oranlara sahipti. Bu düşük olasılıklı bir olay olsa da, yeterince hücreyi düzenlediğinizde – ki terapiler genellikle birçok hücreyi düzenlemeyi gerektirir – hatalar kaçınılmaz hale gelir.
Hedef dışı düzenlemeleri en aza indirmek veya ortadan kaldırmak için birçok çaba harcandı. Yakın zamanda yayımlanan bir bilimsel makalede araştırmacılar, gen düzenleme proteinlerinin hedef dışı etkilere neden olan kritik bölgelerini belirlemeye yardımcı olmak için AlphaFold yapay zeka destekli protein katlanma yazılımını değiştirdiklerini açıkladılar. Ardından bu bölgeler, sorunları azaltmak amacıyla modifiye edildi.
Gen Düzenleme ve Hedef Dışı Etkiler
Gen düzenleme sistemlerinin üç ana bileşeni vardır. Birincisi, hedeflenen genom dizisiyle eşleşebilen 'rehber RNA'dır. Aynı geni hedefleyen birçok rehber RNA tasarlamak mümkündür, bu nedenle sistemi daha güvenli hale getirmenin bir yolu, başka genetik konumlara çok az benzerlik gösteren dizileri seçmektir. Bu artık gen düzenleme sistemlerinin temel tasarım sürecinin bir parçası olarak yaygın şekilde kullanılıyor.
İkinci bileşen, CRISPR sisteminin Cas9 proteiniyle adlandırılan bir Cas proteinidir. Hem rehber RNA hem de genomik RNA ile etkileşime girer ve etkileşimlerin özgüllüğünü sağlamaya yardımcı olur.
RNA ve DNA arasındaki eşleşmelerde çok fazla yanlışlık varsa, Cas9 (veya diğer Cas ailesi üyeleri) orada durmaz. Çeşitli yaklaşımlar, hedef dışı düzenlemelerin eğilimini azaltan geliştirilmiş Cas ailesi üyeleri ortaya çıkardı.
Sistemin son anahtar bileşeni, Cas9'un DNA'ya bağlandığında onunla etkileşime giren ve DNA'yı modifiye eden proteindir. Orijinal CRISPR sisteminde bu, çift sarmalın her iki ipliğini de keserek kontrolü zor hasara neden oluyordu. Araştırmacılar o zamandan beri Cas9 ile etkileşime giren ancak DNA'da tek bir bazın koparılması veya kimyasal modifikasyonlar gibi daha ince değişiklikler katalize eden başka proteinler modifiye ettiler.
Genel olarak, rehber RNA'lar ve genom arasındaki eşleşmelerin uzunluğu yaklaşık 18 baz civarındadır. Bu, rastgele DNA dizilerinde yaklaşık yetmiş milyarda bir kez görünmeli ve bizim genomumuz yaklaşık üç milyar bazdır. Bu ölçüte göre iyi olmalıyız. Ancak Cas9, DNA'ya tutunma yeteneğini kaybetmeden küçük bir miktar yanlış eşleşmiş bazı bazlara tolerans gösterebilir. Varyasyonlara tolerans gösterilen bazların tam sayısı ve konumu bir miktar değişebilir, bu da hangi rehber RNA'ların tehlike oluşturabileceğini önceden belirlemeyi zorlaştırır.
Güvenliği artırmanın bir yolu, bu hedef dışı etkileşimlerin nasıl oluştuğunu daha iyi anlamaktır.
Temas Noktalarını Belirlemek
Çin'deki çeşitli kurumlarda bulunan yeni çalışmanın arkasındaki ekip, yaklaşımlarını önceden planladı. Mükemmel bir şekilde eşleşen bir DNA-RNA hibritinin bir yapısı olurken, bir veya daha fazla yanlış eşleşmiş baz içeren bir yapının biraz farklı bir yapısı olacaktır. Evrim, Cas9'un yapısını ilkine tutunacak şekilde optimize etmiştir. Ancak bu, Cas9'un yanlış eşleşmiş yapılarla etkileşime girebilen biraz farklı şekiller almasını engellememiştir.
Cas9'un bu sorunlu etkileşimleri aracılık eden kısımlarını belirleyebilirsek, onları modifiye edebilir ve potansiyel olarak engelleyebiliriz.
Ekibin ilk adımı, geniş bir hedef dışı düzenleme sitesi kütüphanesi oluşturmaktı. Bunu, adenin bazını ilgili bir kimyasal olan inozine dönüştüren modifiye edilmiş bir CRISPR sistemi kullanarak ve ardından bunu içeren herhangi bir DNA parçasını izole ederek yaptılar. Bu işlemi 10 farklı rehber RNA ile tekrarladılar ve her birinden çok sayıda modifiye edilmiş DNA parçasını analiz ederek mevcut hedef dışı dizilerin türleri hakkında geniş bir resim elde ettiler.
Bir sonraki adım, AlphaFold yapay zeka destekli protein katlanma yazılımını kullanarak CRISPR kompleksinin onlarla nasıl etkileşime girdiğini incelemekti. Güncellenmiş sürümler, proteinler ve nükleik asitler arasındaki etkileşimlerin yanı sıra çok proteinli kompleksleri de işlemek üzere tasarlanmıştı. Bu nedenle ekip, bir hedef DNA dizisinin AlphaFold versiyonlarını, bir rehber RNA, Cas9 dizisi ve bazları kimyasal olarak modifiye edebilen ve Cas9'a yapışabilen bir enzim ile birlikte besledi. Ne yazık ki, proteinlerden birini açıkça yanlış bir konuma yerleştirerek başarısız oldu.
Pes etmeyen ekip, işleri basitleştirerek AlphaFold'a yalnızca DNA, RNA ve Cas9 proteinini besledi, çünkü sonuncusu dizinin özgüllüğünü belirleyen birincil faktördür. Bu, gerçek nükleik asitler ve proteinlerle yapılan deneylerle tutarlı bir yapı üreterek çok daha iyi çalıştı.
Araştırmacılar, AlphaFold'un farklı hedef içi ve hedef dışı sitelerle beslendiğinde ürettiği yapıları karşılaştırarak genel bir örüntü buldular. Hedef dışı sitelerin çoğu (yaklaşık üçte ikisi), Cas9 proteininin biraz farklı bir yapı benimsemesine neden oluyordu. Ancak bunların neredeyse tamamı (%95'in üzerinde), RNA ile temas eden amino asitleri değiştirdi. Bu nedenle, Cas9'un normal yapısını koruduğu ancak içindeki amino asitlerin, hedef dışı sitelerin yanlış eşleşmiş bazlarını karşılayacak şekilde esnediği bazı durumlar açıkça vardır.
Kullanışlı bir şekilde, AlphaFold, 'temas olasılığı' olarak adlandırılan şeyi belirlemek için zaten ayarlanmıştı, yani herhangi iki öğenin, örneğin amino asitlerin veya nükleotitlerin, çok küçük bir mesafe (sekiz Angstrom) içinde olma olasılığı. Araştırmacılar, hedef içi ve hedef dışı siteler için temas olasılığı analizinin çıktısını alıp bunları karşılaştırarak, Cas9'daki hangi amino asitlerin, rehber RNA ve DNA arasında bir yanlış eşleşme olduğunda değişen temaslara sahip olduğunu belirleyebildiler. Bu bilgisayarlı analiz kurulumuna 'ContactSeek' adını verdiler.
Daha İyi Hedefleme
ContactSeek tek başına, hedef dışı bir siteye bağlandığında kayan büyük bir amino asit listesi üretme eğilimindeydi. Bu nedenle araştırmacılar, bu amino asitlerin kümelendiği Cas9 proteini bölgelerine odaklandılar ve bunu, bu alanların yanlış eşleşmiş bazlardan kaynaklanan farklılıklara uyum sağladığının bir işareti olarak gördüler. Ardından, bu bölgelerde farklı amino asitlere sahip Cas9 versiyonlarını test etmeye başladılar.
Araştırmacılar toplamda 23 farklı değişim yaptılar, AlphaFold ile yaptıkları çalışmalarda belirlenen 10 kilit pozisyondan birine farklı bir amino asit yerleştirdiler. Bu, normal Cas9 ile benzer aktiviteye sahip, hedef diziyle eşleşen sitelerde çalışan bir varyant bulmalarını sağlarken, hedef dışı aktivitesi %28'den %5'e düştü. Araştırmacılar farklı rehber RNA'lar kullandığında benzer sonuçlar elde edilebildi. Ayrıca, bu yaklaşımın, DNA/rehber RNA kombinasyonunu tanımak için farklı bir Cas proteini (Cas12) kullanan benzer bir sistem için de çalıştığını gösterdiler.
Yukarıda belirtildiği gibi, diğer araştırma ekipleri, hedef dışı düzenlemelere daha az eğilimli Cas9 varyantları geliştirmek için yönlendirilmiş evrim gibi farklı yaklaşımlar kullandılar. Bu varyantlara karşı test edildiğinde, yeni tasarlanan versiyonlar benzer veya hatta biraz daha iyi aktivite ve özgüllük üretti. Buradaki büyük fark, bu yaklaşımın belirlediği değişikliklerin, daha genel olarak etkili olmaktan ziyade, belirli bir rehber RNA/yanlış eşleşme kombinasyonuna daha özgü olabilmesidir.
Elbette, burada belirlenen bireysel değişikliklerin bazıları, daha da büyük iyileştirmeler için daha önce geliştirilmiş Cas9 versiyonlarındaki değişikliklerle birleştirilebilir, ancak bu burada test edilmedi.
Her durumda, çalışma potansiyel olarak kullanışlıdır çünkü bilinen hedef dışı olayları önlemek için tasarlanmış gen düzenleme sistemleri üretmek için genel bir yöntem tanımlar. Eğer bu, bir terapi geliştirilmesinde bir darboğaz haline gelirse, bu çalışma önemli bir atılım olabilir. Ancak araştırmacılar ayrıca, bu yaklaşımın, gen düzenlemenin çok ötesinde uygulamalara sahip olabilecek protein-DNA etkileşimlerini ince ayarlamak için daha genel olarak faydalı olacağını öne sürüyorlar.
