CRISPR/Cas9 gen düzenleme sisteminin yetenekleri keşfedilmeye başlandığı ilk günlerden bu yana, araştırmacılar bu teknolojinin hedefli gen düzenlemede kullanılabileceği potansiyelini fark ettiler. Ancak bu alandaki ilerleme, insan kullanımı için güvenli yöntemlerin belirlenmesi yönündeki çalışmalarla birlikte yavaş bir süreç izledi. CRISPR'ın keşfedilmesinden on yıllar sonra, sadece iki yıl kadar önce FDA, orak hücre anemisi için ilk CRISPR tabanlı terapinin onayını verdi.
Şimdi, bu başarının ardından, kapsamlı bir Çinli araştırma ekibi, daha odaklı değişiklikler ve daha az hata üreten geliştirilmiş bir gen düzenleme sistemini tanıttı. Bu sistemi kullanarak, orak hücre anemisine yakından bağlı bir hastalık olan Beta-Talasemi'yi tedavi etmeye yönelik bir terapi geliştirdiler.
Gen Düzenleme ve Sınırları
CRISPR-Cas9 sistemi, bakterilere bir tür bağışıklık kazandırır. Hedeflenen bir dizi ile eşleşebilen özel olarak yapılandırılmış RNA'lar (rehber RNA'lar) kullanır. Cas9 proteini bu yapıyı tanıyarak yakındaki DNA'yı keser. Rehber RNA bir DNA virüsü ile eşleşebildiğinde, ortaya çıkan kesik virüsü etkisiz hale getirdiğinden bu oldukça etkilidir.
Bunun, bizler gibi organizmalarda DNA düzenlemesi için kullanılabilecek birkaç yolu vardır. Bu yöntemlerin her ikisi de, hücrelerdeki DNA onarım sistemlerinin bu kesiklerin uçlarını birleştirirken genellikle geriye doğru çiğnediği gerçeğinden yararlanır. Bu, sıklıkla kesik yerinde küçük silinmelere yol açar ve bu da genleri devre dışı bırakmak için kullanılabilir. Bu silinmelerin boyutu değişebilir, bu nedenle ilgilenilen geni devre dışı bırakan ancak ek bir zarar vermeyen bir silinme bulmak için DNA dizilemesi yapmak gerekir.
Alternatif olarak, herhangi bir silinmiş dizi bazen eşleşen bir dizi kullanılarak onarılabilir, bu da tipik olarak aynı kromozomun diğer kopyasında bulunur. CRISPR tabanlı kesim, çok sayıda değiştirilmiş dizi kopyası ile birlikte yapılırsa, onarım sistemlerinin modifikasyonları genom'a yerleştirmesi ve böylece gerçek bir düzenleme yeteneği sağlaması mümkündür. Ancak yine de, bu süreç hataya açıktır, bu nedenle insanlar genellikle birçok hücreyi düzenlemeli ve doğru değişikliklerin yapıldığından emin olmak için DNA'yı dizilemelidir.
Ve tüm bunların arka planında, CRISPR/Cas9'un genomda benzer görünen başka bir diziyi kesme riski yatar. Bu hedef dışı kesimler öngörülemeyen etkilere sahip olabilir ve çoğu gen düzenleme deneyi, bunlara sahip herhangi bir hücreyi ortadan kaldırmak için ek tarama gerektirir.
Tüm bunlar, ilk CRISPR tabanlı terapilerin kan kök hücrelerinde gerçekleşmesinin nedenidir, çünkü bu hücreler kültürde büyütülebilir. Yaklaşım, birçok hücrede düzenleme yapmayı, ardından hedef dışı düzenlemeleri olmayan hücreleri taramayı ve hedeflenen düzenlemenin amaçlanan sonuca ulaştığı hücreleri seçmeyi içerir. Henüz pek göremediğimiz şey ise vücutta büyük bir hücre popülasyonunda gerçekleşmesi gereken düzenleme türüdür, çünkü orada bir şeyler ters giderse, bir sorun bulsak bile bunu anlayamayabiliriz veya hakkında bir şey yapamayız.
CRISPR Gibi, Ama Daha İyi
Tüm bunlara rağmen, daha hassas bir CRISPR versiyonu yapmaya yönelik çok çaba harcandı ve yeni çalışma bunlardan bazılarını kullanıyor. Burada kullanılan yaklaşımlardan biri Cas9'un ortadan kaldırılmasını içerir, çünkü yaptığı çift zincirli kırıklar öngörülemeyen sonuçların çoğunun kaynağıdır. Bunun yerine, bu yöntemler genellikle bir veya daha fazla tek baz değişikliği içerir. Ve diğer yöntemler, hedef dışı kesimleri önleyerek aktiviteyi yalnızca genomda tek bir yere sınırlamak için kullanılmıştır.
Burada kullanılan sistem, bir nitrojeni sitozin (C) bazından kimyasal olarak koparan bir protein içerir ve bunu timidin (T) gibi eşleşen bir şeye dönüştürür. Bu, seçilen diziyi hedefleyen CRISPR tarzı rehber RNA'ya yapışabilen bir proteine birleştirilir. Ayrıca inaktif bir formda bulunur ve aktive edilmesi için ayrı bir enzim (bir proteaz) gerektirir. Bu enzimin anahtar bir kısmı da rehber RNA'ya bağlıdır, bu nedenle mutasyon üreten enzim yalnızca tam rehber RNA kompleksi mevcut olduğunda aktive edilecektir.
Buradaki bir karmaşıklık, bu sistemin oluşturduğu mutasyonların - C -> T değişikliklerinin - hücrelerimizin özellikle onaran enzimlere sahip olduğu kadar yaygın olmasıdır. Bu nedenle, rehber RNA'ya bağlı diğer bir şey, bu DNA onarım sistemini engelleyen bir bakteri proteinidir. Temel olarak, bu kompleks sadece belirli yerlerde mutasyonlar oluşturmakla kalmaz, aynı zamanda bu konumlarda düzeltilmelerini de engeller.
Bu nedenle, bu faaliyetlerden herhangi biri - baz editörü, onu aktive eden enzim ve onarım inhibitörü - yanlış yerde geçici olarak aktive olsa ve mutasyonlar oluştursa bile, bunların hepsinin bir süre etrafta olması gerekir. Ve bunun, rehber RNA'ya mükemmel bir dizi eşleşmesinin özel olarak hedeflenmesini gerektirdiği düşünülmektedir.
Araştırma ekibi, makalede bunun böyle olduğunu gösteren oldukça zaman harcadı. Bu sistemin, bazı rakip sistemlere göre daha düşük bir verimlilikle (%30 civarında, iki katından fazla frekansa kıyasla) mutasyonlar ürettiğini, ancak faydasının hedef dışı kesimlerin tamamen yok olması olduğunu bulmuşlardır.
Hastalığın Tedavisi
Geniş bir mutasyon yelpazesi Beta-Talasemi'ye neden olur ve bunların hepsinin tek bir düzenleme sistemiyle düzeltilebileceğini düşünmek gerçekçi değildir. Bu nedenle araştırmacılar, onlarca yıldır üzerinde düşünülen bir yaklaşıma başvurdular: genin fetal versiyonunu yeniden etkinleştirmek. Bu versiyon, normal hemoglobinden daha yüksek oksijen afinitesine sahiptir, bu da onun annenin kan dolaşımındaki hemoglobinden oksijeni kapmasına olanak tanır. Bu gen normalde yetişkinlerde kapatılır.
Genin DNA'sına özel olarak bağlanan ve onu kapatmak için gerekli olan anahtar bir protein belirledik. Buradaki gen düzenlemeleri, bu inhibitörün bağlandığı bölgeyi basitçe zarar verir, bu da fetal genin yetişkinlerde aktif olmasına izin verir. Bu düzenleme, hastalardan alınan kan kök hücrelerinde yapıldı ve yalnızca başarılı düzenlemelerden büyüyen ve hedef dışı sorunları olmayan hücreler tekrar nakledildi.
Buradaki klinik çalışma, yalnızca beş Beta-Talasemi hastasını içeren temel bir güvenlik testidir. Kök hücrelerinde düzenleme yapıldıktan sonra, mevcut kök hücre popülasyonlarını ortadan kaldıran bir kemoterapi ile tedavi edildiler. Bu prosedürün bazı belirgin yan etkileri vardır ve bu hastaların hepsinde bu yan etkiler görüldü, ancak hepsi nakilden sonra en az bir yıl boyunca denemeye kayıtlı kaldı.
Ve işe yaradı. Birkaç hafta sonra, kanda hemoglobin seviyeleri yükselmeye başladı ve tüm hastalar denemenin ana başarı ölçütünü karşıladı: Beta-Talasemi'yi kontrol etmek için transfüzyona ihtiyaç duymadan altı aydan fazla bir süre.
Genel olarak, araştırmacıların bu yaklaşımla gördükleri en büyük sorun maliyettir. Hücre kültürü ve DNA dizileme işlemlerinin tümü maliyetli, ayrıca nakil protokolü önemli tıbbi müdahaleler içeriyor. Ve bu adımların hiçbiri, güvenliği tehlikeye atmadan gerçekten atlanamaz. Uzun vadede, Beta-Talasemi hastaları için gereken sağlık yönetimi göz önüne alındığında, bunun dengelenebileceği tamamen mümkündür. Yaşam kalitesi değişiklikleri hakkında haberler duymak için biraz beklememiz gerekecek, ancak bunların da önemli olması muhtemeldir.
Maliyet konusunda sorular olsa da, sonuçlar gen düzenlemenin, önemli zorlukları olan umut verici bir teknolojiden, birden fazla terapi üretebileceğimiz bir şeye dönüştüğünü vurguluyor. Ve, bu ilk nesil yaklaşımları nasıl uygulayabileceğimize dair hala birçok sınırlama olsa da, bunlardan sonraki nesilleri üretebilecek birçok ek fikir olduğu açıktır.
